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當前位置:首頁 > 產品中心 > Mich Scientific > 建庫試劑 > NGS 0602-96MICH TLX DNA建庫試劑盒

MICH TLX DNA建庫試劑盒

簡要描述:MICH TLX DNA建庫試劑盒是為illumina平臺設計的 DNA 文庫準備試劑盒,適用于起始量1 ng-200 ng 的 DNA 樣本,試劑盒經過精心設計和優化,能夠快速構建文庫(2.5-3.5小時),有高效的文庫轉化率與擴增效率。

  • 產品型號:NGS 0602-96
  • 廠商性質:生產廠家
  • 更新時間:2023-06-02
  • 訪  問  量:790

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詳細介紹

供貨周期現貨主要用途用于DNA建庫。
應用領域環保,生物產業,農業,制藥

MICH TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)

MICH TLX DNA建庫試劑盒   #NGS 0602-96(96 rxns)

 

MICH TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) 是為 illumina 平臺設計的 DNA 文庫準備試劑盒, 適用于起始量 1 ng-200 ng 的 DNA 樣本,試劑盒經過精心設計和優化,能夠快速構建文庫(2.5-3.5 小時),有高效的文庫轉化率與擴增效率,已經經過多樣本驗證可獲得優異的文庫與測序數據,可 用于石蠟包埋組織 DNA 樣本建庫。試劑盒包含了 DNA 片段化和末端修復加 A 尾的預混液、連接預 混液、高保真擴增預混液、短接頭和含有 INDEX 的 PCR 引物(可以根據客戶要求進行選配)。

 

產品組分

TLX Buffer Mix

TLX Enzyme Mix

TLX ligase Enzyme

TLX ligase Buffer

TLX Adapter for ILM

PCR Master Mix


使用方法

磁珠: Cat#A63881,AMPure XP Beads 或其他等效產品。  

DNA 質 控:Cat#Q33238,life qubit4.0;Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 或 其 他等效產品。  

其他材料:Nuclease-free water、低吸附 EP 管、無水乙醇、TE Buffer(10 mM TrisHCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、磁力架、PCR 管、PCR 儀等。


使用流程 

DNA 文庫準備流程圖.png
圖1. DNA 文庫準備流程圖

實驗步驟
片段化 / 末端修復 / 加 A 尾(Fragment/End Preparation/dA-Taling)
1. 將所需試劑解凍后,顛倒混勻,置于冰上備用。
2. 于無菌 PCR 管中配制下表所示反應體系。

 

 

劑名稱

體積

TLX Buffer Mix

4 μL

TLX Enzyme Mix

3.2 μL

gDNA

X

Nuclease-free water

Up to 20 μL

1. 片段化 / 末端修復 /dA 尾反應體系


3. 吹打或振蕩混勻,并短暫離心將反應液離心至管底。
4. 按下表設置反應程序(熱蓋設置為 82℃)  ,將上述 PCR 管置于 PCR 儀中反應。

 

溫度

時間

37℃

20 min

72℃

20 min

4℃

Hold

2. 片段化 / 末端修復 / dA 尾反應程序

 接頭連接(Adapter Ligation)
1. 將所需試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。
2. 如下表所示配制反應體系。

劑名稱

體積

dA-tailed DNA(3.1 步驟產物)

20 μL

TLX ligase Enzyme

2 μL

TLX ligase Buffer

8 μL

TLX Adapter for ILM

2 μL

Nuclease-free water

Up 40 μL

3. 接頭連接反應體系(接頭詳細說明見注意事項 )


3、吹打或振蕩混勻,并短暫離心將反應液離心至管底。

4、將上述 PCR 管置于 PCR 儀中 22℃,孵育 60min。
【注】:當投入 DNA 量較低,實驗效果不理想時,可嘗試將連接時間延長。

連接產物磁珠純化(Post Ligation Clean Up)

A. 產物純化操作步驟(必選)
1、準備工作:將 AMPure XP Beads 室溫平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、吸取 48 μL AMPure XP Beads   (1 .2×,Beads:DNA=1.2:1)  至接頭連接產物中,  渦旋混 勻或移液器吹打 10 次混勻,室溫孵育 5 min。
3、短暫離心并置于磁力架上,待溶液澄清后(約 5 min),棄上清。
4、保持 PCR 管始終置于磁力架中,加入 200 μL 新鮮配制的 80% 乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec,棄上清。
5、重復步驟 4。
6、保持 PCR 管始終置于磁力架中,開蓋干燥磁珠至剛出現龜裂(約 5 min)*。
7、   
1)  如產物無需進行片段分選,將 PCR 管從磁力架中取出,磁珠 ( 無需用水洗脫 ) 直接用于文庫擴增步驟反應。


2)  如產物需進行雙輪分選,  加入 52-102 μL Nuclease-free Water,渦旋振蕩或輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置 5 min。將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清 后(約 5 min)  ,小心移取 50-100 μL 上清至新 PCR 管中,切勿觸碰磁珠(洗脫體積越大,洗脫效率越高,分選效果越好,詳細說明見注意事項)。

* 等待磁珠干燥過程中,可配制 文庫擴增步驟反應體系。


B. 雙輪分選操作步驟(可選)

1、準備工作:將 AMPure XP Beads 室溫平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、根據 DNA 片段長度要求,參考表 4 向純化產物中加入第一輪分選磁珠,渦旋混勻或移液 器吹打 10 次混勻。

DNA 片段大小

150 - 250 bp

200-300 bp

300-400 bp

400-600 bp

500-700 bp

DNA 文庫大小

250 - 350 bp

300-400 bp

400-500 bp

500-700 bp

600-800 bp

一輪磁珠體積

0.70X

0.65X

0.62X

0.48X

0.44X

二輪磁珠體積

0.25X

0.25X

0.16X

0.16X

0.16X

4 文庫雙篩對應磁珠體積參照表

【注】:表中“0.7×”表示樣品 DNA 體積的 0.7 倍。如文庫插入片段長度為 200 bp,樣品 DNA 體積為 100 μL,則第一輪分選磁珠使用體積為 0.70×100 μL=70 μL;第二輪分選磁珠使用體積為 0.25×100 μL=25 μL。


3、室溫孵育 5min。將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約 5 min)  ,小 心轉移上清到干凈的 PCR 管中。
4、參考表 4 向上清中加入第二輪分選磁珠。渦旋混勻或移液器吹打 10 次混勻,室溫靜置 5 min。
5、 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約 5 min),棄上清。
6、保持 PCR 管始終處于磁力架中,加入 200 μL 新鮮配制的 80% 乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec,棄上清。
7、重復步驟 6。
8、保持 PCR 管始終處于磁力架中,開蓋干燥磁珠至剛出現龜裂(約 5 min)*。
9、將 PCR 管從磁力架中取出,磁珠 ( 無需用水洗脫 ) 直接用于文庫擴增實驗。
* 等待磁珠干燥過程中,可配制 文庫擴增步驟反應體系。


文庫擴增(Library Amplification)

1、將表 5 所需試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。
2、如下表所示配制反應體系。

劑名稱

體積

Adapter Ligated DNA(3.3 步驟產物)

干燥后的磁珠

PCR Master Mix

10 μL

I7 Primer

1 μL

I5 Primer

1 μL

Nuclease-free water

8 μL

5 庫擴增反應體系 

【注】:  含有 Index PCR 引物(i5 Prmier i7 Primer)  信息詳見 MichTM TLX Primer Kit(Catalog #NGS CD-0602-C)說明。

3、將配置好的 PCR 反應液加入到 3.3.1 或 3.3.2 步驟完成后的含有磁珠的 PCR 管中,  吹打或 振蕩混勻,并短暫離心。

4、按下表設置反應程序,將上述 PCR 管置于 PCR 儀中反應。

溫度

環數

98℃

2 min

1

98℃

30 s

照注意事項四:關于文庫擴增的表 1

65℃

30 s

72℃

40 s

72℃

4 min

1

4℃

Hold

*

6 PCR 擴增反應程序


產物磁珠純化(Post Amplification Clean Up)

同:產物純化操作步驟。使用 AMPure XP Beads(1×,Beads:DNA=1:1)  純化文擴增產物,  最后加適量 Nuclease-free water(20-50 μL)  進行洗脫(產物如需保存請 使TE Buffer 洗脫)。

文庫質量控制

通常情況下,構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價,具體請參見:注意事項中的關于文庫質檢。


注意事項
關于操作
1、請穿實驗服并戴一次性手套進行實驗。
2、使用前請將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。
3、混勻時請輕輕吹打或輕輕振蕩,劇烈振蕩可能會造成文庫產出下降。
4、為避免樣品交叉污染,推薦使用帶濾芯的一次性槍頭。
5、推薦在帶熱蓋的 PCR 儀中進行各步驟反應,使用前應預熱PCR 儀至反應溫度附近。
6、請在潔凈的實驗環境下實驗,避免污染。

TLX Adapter for ILM 說明
1、TLX Adapter for ILM 采用短接頭模式。
2、接頭濃度:15 μM; 直接用于相應建庫試劑盒連接體系里即可。
3、-20℃保存,使用前提前融化,盡量低溫融化,避免在超過 30℃的環境中融化。
4、建庫推薦使用量:常規 DNA 投入量 100-200 ng, 2 μL/rxns;其他 DNA 投入量需要適當調 整接頭使用量。

關于磁珠純化與分選
1、DNA 片段選擇步驟可在接頭連接后或文庫擴增后進行。
2、 Input DNA 質量≥ 50 ng,  建議在接頭連接后分選;  如 Input DNA 質量<50 ng,  可在 文庫擴增后進行分選。
3、TLX Ligase Buffer 包含高濃度的 PEG,對雙輪磁珠分選產生顯著影響。因此,當在接頭 連接后進行片段選擇,須先進行純化步驟,再進行雙輪分選步驟;如在文庫擴增后進行片 段選擇,可直接進行雙輪磁珠分選步驟。
4、磁珠使用前應先平衡至室溫,并混勻再使用,否則會導致得率下降。
5、80% 乙醇應現用現配,否則將影響回收效率。
6、進行片段選擇時, 初始樣品體積應盡量≥ 100 μL, 初始樣本體積越大, 片段選擇效果越好。

關于文庫擴增

1、文庫擴增循環數與文庫產量和文庫質量有直接關系,請參照下表列舉的本試劑盒設置擴增 循環數,并摸索合適的循環數。

DNA 投入量

獲得 100 ng 文庫需要循環數

獲得 300 ng 文庫需要的循環數

250 ng

1-4

5-7

100 ng

2-5

6-8

50 ng

4-7

8-10

10 ng

6-8

9-12

5 ng

7-10

11-14

1 ng

9-11

12-15

1. 文庫擴增循環數參照表

【注】:如文庫擴增后需要做片段選擇時參照較高循環數擴增。


關于文庫質檢
1、通常情況下,構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。
2、文庫濃度檢測可使用:基于雙鏈 DNA 熒光染料的方法, 如 Qubit® 或 qPCR 絕對定量的方法。
3、文庫長度分布檢測,可通過 Agilent Bioanalyzer 2100 等基于毛細管電泳或微控流原理的 設備進行檢測。

運輸與保存方法

 -20℃運輸。
所有組分 -20° C 保存,有效期 1 年。


MICH TLX DNA建庫試劑盒產品信息

 

品貨號

名稱

規格

NGS 0602-8

MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)

8 rxns

NGS 0602-24

MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)

24 rxns

NGS 0602-96

MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)

96 rxns

  

 

 

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